TCR-T细胞治疗癌症：当前策略、挑战和前景

  免疫疗法已迅速崛起，成为癌症治疗的主要支柱之一。其中，TCR工程化的T细胞疗法是一个迅速增加，活跃和发展的领域。

  为了将T细胞重定向到肿瘤细胞，T细胞可以在体外进行工程设计以表达癌症抗原特异性T细胞受体（TCR），由此产生称为TCR工程T细胞（TCR-T）的产物。与嵌合抗原受体（CAR）不同，TCR识别来自所有细胞区室蛋白质的HLA呈递肽。将TCR-T细胞用于过继细胞疗法（ACT）已受到慢慢的变多的关注，特别是随着ACTs治疗实体癌的努力日益加强。本文描述了通过CARs和TCRs介导的T细胞抗原识别和信号转导的不同机制。描述了当前TCR-T疗法认可的癌症抗原类别，并讨论了抗原特异性TCR发现，增强和验证的经典和新兴临床前策略。最后，回顾了TCR-T疗法临床试验的现状，并讨论了这些当前结果对未来工程TCR方法的发展有何启示。

  在过去的几十年里，我们对免疫细胞抗肿瘤功能背后的机制的理解有了快速的进步，因此，过继细胞治疗（ACT）策略已成为癌症治疗的主要平台。ACT的一个里程碑是20世纪80年代开始肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗转移性黑色素瘤的成功。虽然TIL治疗仍然是ACT的重要方式，但TIL产品的制造上具有挑战性。因此，ACT的努力在很大程度上已经转向了用赋予所需抗原特异性的受体来设计外周血T细胞的策略。这些最重要的包含嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和T细胞受体工程T细胞（TCR-T）疗法。由于CAR-T疗法在治疗B细胞恶性肿瘤方面的显着疗效，对CAR-T疗法的兴趣已超越了TCR-T疗法。然而，TCR-T疗法正引起人们的兴趣，因为CAR-T试验迄今未能在实体癌治疗中引起令人满意的反应，许多人认为TCR可能更适合治疗实体癌。事实上，令人兴奋的临床结果正在出现，证明了TCR-T疗法在血液病和实体癌中的安全性和有效性。本文介绍了TCRs的生物学和肿瘤抗原靶标，并讨论了TCR发现和临床前评估的最新技术。最后，描述了TCR-T试验的现状以及任旧存在的挑战。

  传统T细胞通过其T细胞受体（TCR）识别MHC呈递的抗原，TCR是一种由α和β链组成的二硫键连接的异源二聚体。为了形成功能性受体，TCR α/β异源二聚体进一步与CD3ε/γ/δ/ζ亚基复合。TCR识别由MHC分子（pMHC）在细胞表面呈递的酶切割肽。在人类中，抗原呈递的MHC等位基因大致分为HLA I类（A，B或C）或HLA II类（DR，DP或DQ），它们分别主要存在细胞质或细胞外衍生肽。辅助受体CD8和CD4分别通过与MHC I类或II类分子的相互作用来增强TCR抗原敏感性。TCR与同源pMHC的结合导致CD3亚基细胞内区域中基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAM）的磷酸化，这导致T细胞活化和效应器功能的启动，包括增殖，细胞因子分泌和通过流孔素和颗粒酶的细胞溶解（图1)。在TCR T疗法中，T细胞被编辑以表达TCR α和β链并赋予所需特异性。在这里，引入TCR α，β链与内源性CD3组分二聚并复合，形成功能性TCR，将T细胞特异性重定向到目标抗原。

  图1 通过CARs和TCRs识别抗原，CARs通常通过抗体衍生的scFv识别域识别表面蛋白。抗原识别通过偶联细胞内CD3ζ结构域中ITAMs的磷酸化导致T细胞活化。对于下一代CARs，配体结合还会导致共轭共刺激受体（例如CD28，4-1BB）的额外刺激。TCR识别可能来自任何细胞区室的HLA呈递肽。通过TCRs识别抗原，通过相关CD3ε/γ/δ/ζ亚基中ITAMs的磷酸化导致T细胞活化。根据T细胞亚型，通过任一受体类型的T细胞活化将触发效应器功能，包括增殖，细胞因子分泌和通过穿孔素和颗粒酶的定向分泌杀伤靶细胞。

  重定向T细胞特异性的另一种常用方法是通过嵌合抗原受体（CARs）的遗传转移，其广泛地由与细胞内免疫细胞激活信号传导结构域相连的面向细胞外的抗原结合结构域组成。大多数情况下，CARs通过抗体的单链可变片段（scFv）识别抗原。在典型的CAR设计中，抗原结合scFv通过铰链或间隔区连接到跨膜结构域，该跨膜结构域进一步偶联到细胞内CD3ζ信号传导结构域。以这种方式，scFv的抗原结合驱动CD3ζ磷酸化和下游T细胞活化。下一代CAR包括添加细胞内共刺激结构域，如CD28和4-1BB，这进一步改善了CAR T的功能和持久性（图1）。

  虽然TCRs在HLA呈递的背景下识别抗原，但CAR在细胞表面识别天然折叠的蛋白质。因此，CARs克服了TCR的HLA限制所施加的临床局限性。HLA编码基因是人类基因组中多态性的，迄今为止已鉴定出超过20,000个HLA I级等位基因。因此，与CAR-T治疗不同，选择TCR-T治疗的患者不仅必须表达靶向抗原，还必须表达相应的抗原限制性HLA等位基因。因此，TCR-T疗法通常使用仅限于相对常见的HLA等位基因的TCR，例如HLA-A * 02:01，分别存在于美国约47.8%和16.8%的高加索人和非裔美国人人群中。

  由于CARs和TCRs利用不一样的信号机制，它们在对抗原刺激的功能反应方面表现出几个重要的差异。虽然TCRs可以引发对单个pMHC分子的细胞毒性反应，但CARs常常要数千个靶表面分子来介导有效反应。CARs抗原敏感性降低的结果见于最初对CAR-T治疗有反应但随后随着抗原低癌细胞进展而复发的B细胞恶性肿瘤患者。刺激后，CARs介导超生理性T细胞活化，导致细胞因子分泌增强。因此，与TCR-T细胞相比，CAR-T细胞在患者中更容易引起细胞因子释放综合征（CRS）;然而，治疗的最新进展使CRS在临床上通常可控。

  CARs识别的肿瘤抗原必须位于癌细胞的表面。相反，TCRs识别可能来自任何细胞区室的HLA呈现的肽。由于跨膜蛋白仅占蛋白质组的14-26%，因此CAR靶向抗原的局限性要大得多。然而，CAR靶向抗原的库在某些特定的程度上通过CAR不仅仅可以识别蛋白质抗原，且能识别其他分子，如糖蛋白和糖脂。潜在靶向抗原库的这种差异对CAR-T和TCR-T疗法具备极其重大意义，它们必须积极靶向肿瘤细胞，同时避免针对健康组织的毒性。事实上，靶抗原在正常细胞上的表达可导致T细胞介导的健康组织破坏，称为“on-target off-tumor”毒性。因此，靶抗原仅由癌细胞表达的程度是一个主要的因素。到目前为止，CAR T疗法的主要成功在于治疗靶向CD19的B细胞恶性肿瘤，CD19是一种在恶性和健康的B细胞上无处不在的抗原。虽然CD19指导的CAR T疗法导致恶性和健康的B细胞的消融，但这种靶向肿瘤外毒性能够最终靠替代抗体疗法在临床上得到控制。然而，在许多别的类型的癌症的情况下，包括几乎所有的实体癌，这种T细胞介导的健康器官组织的消融在临床上是不可控的，因此靶向抗原在癌细胞中具有表达的排他性是最好的。目前描述的在癌细胞中表达特异性最高的肿瘤抗原主要是细胞内衍生的抗原，可与TCRs结合，但不能与CARs结合。因此，TCR-T疗法可能比CAR-T疗法具有优势，能够积极靶向癌细胞，同时最大限度地减少毒性。

  在确定介导免疫排斥的精确癌症抗原方面取得了重大进展。虽然描述肿瘤抗原的命名法各不相同，但广泛研究的肿瘤抗原类别包括肿瘤相关抗原（TAAs），癌症生殖系抗原（CGAs）和肿瘤特异性抗原（TSA）（图2）。

  图2 TCR 认可的肿瘤抗原。病毒抗原由正常细胞中不存在的病毒癌基因引起。新抗原起源于正常细胞中未发现的体细胞突变。病毒抗原和新抗原统称为肿瘤特异性抗原（TSA）。癌症生殖系抗原（CGAs）来自通常仅在生殖细胞中表达的蛋白质，例如缺乏HLA I类表达的睾丸。与正常组织相比，过表达的抗原来自癌症组织中高度过度表达的蛋白质。癌症分化抗原由癌细胞表达，除此之外，它们的表达仅限于与癌症具有相同组织来源的正常细胞。过表达的抗原和癌症分化抗原统称为肿瘤相关抗原（TAAs）。

  TAAs由肿瘤细胞表达，但也至少在一些健康组织中表达。因此，靶向TAAs的疗法必须与潜在的T细胞介导的靶向肿瘤外毒性作斗争。TAAs进一步分类为分化抗原或过表达抗原。

  分化抗原由癌细胞以及相同组织来源的正常细胞表达。黑色素瘤分化抗原是最早发现的肿瘤抗原之一，包括广泛研究的黑色素瘤相关抗原，由T细胞（MART-1）和糖蛋白100（gp100）识别。在肿瘤抗原中，分化抗原通常对on-target off-tumor毒性构成最大风险。正如在后文中进一步详细讨论的那样，临床经验表明，靶向分化抗原可能仅在抗原表达仅限于可有可无的健康组织（例如表达CD19的B细胞）时才具有临床适用性。可能是由于这个原因，自2012年以来，只有一项靶向实体癌分化抗原的TCR-T临床试验已经启动。

  过表达的抗原在癌细胞中表达水平很高，但在健康细胞中表达最少。虽然靶向这些抗原继续对靶向肿瘤外毒性构成风险，但癌症和正常细胞之间的差异表达允许实现治疗窗口的可能性，通过该窗口，过继转移的T细胞可以破坏高抗原表达的癌细胞，而对表达低抗原的健康组织的破坏最小。广泛研究的过表达抗原的一个例子是Wilms的肿瘤抗原1（WT1），一种转录因子，与正常细胞相比，白血病细胞中的表达率高出10至1000倍。

  CGAs在癌细胞中异常表达，而它们在正常组织中的表达仅限于生殖系细胞，例如睾丸细胞，其缺乏HLA I类表达，从而大幅度的降低了靶向肿瘤外毒性的风险。因此，CGAs目前是基于TCR的免疫疗法最积极追求的目标之一。具有高临床意义的CGAs的例子包括NY-ESO-1和MAGE-A4，它们在各种实体癌和血液学癌症中被检测到具有高表达水平。然而，一些研究报告说，CGAs在肿瘤内异质表达，这可能会限制靶向单个CGA时的潜在治疗效果。

  TSA在癌细胞中具有遗传编码，但不存在于任何正常细胞的基因组中。TSA进一步分类为病毒抗原或新抗原。

  许多人类癌症是由病毒感染从而引起的，如人瘤病毒（HPV），乙型肝炎病毒（HBV）和 EB 病毒（EBV）。在许多情况下，病毒驱动的癌症是由驱动细胞转化和癌症进展的病毒癌基因的表达介导的。由于病毒癌基因通常在病毒驱动的癌症中均质表达，并且它们在正常细胞中的表达几乎不存在，因此它们代表了高度着迷的肿瘤抗原靶标。临床相关病毒抗原的具体例子包括HPV病毒致癌基因E6和E7，它们在几种类型的上皮癌中表达，以及EBV病毒癌基因LMP1和LMP2，它们在几种实体癌和血液癌症中表达。

  基因组不稳定性是癌症的主要特征，导致许多肿瘤特异性突变的积累。其中一些突变会产生新的蛋白质或新抗原。由于新抗原仅由癌细胞表达，因此这些作为ACT的着迷的靶标，基本上不会对靶向肿瘤外毒性构成风险。然而，一个挑战是，绝大多数癌症突变都是所谓的旁观者突变，它们不会增强癌细胞的适应性。这种随机的、非选择性的突变通常是异质表达的，不太可能在患者之间共享，从而使它们无效的抗原靶标。相反，一小部分癌症突变改善细胞适应性并直接促进癌症进展，这被称为驱动突变。这些突变可能由癌细胞均匀表达，并在特定癌症类型的患者之间共享。如果免疫原性且仅限于常见的HLA，则这种驱动突变会引起所谓的“公共新抗原”。虽然到目前为止很少发现公共新抗原，但这些高度选择性的靶标具备极其重大的临床意义。目前描述的公共新抗原的例子包括KRAS G12D / G12V，在60-70%的胰腺癌和20-30%的结直肠癌同发现，以及PIK3CA H1047L，在约5%的转移性乳腺癌中检测到。

  胸腺发育过程中TCR的V(D)J重组导致人T细胞库内TCR序列的巨大多样性。据估计，在普通成年人中，大约有4 x 10^11总循环T细胞和大约10^10独特的T细胞克隆型。因此，对于绝大多数对非病毒抗原具有特异性的T细胞克隆，外周血中的克隆频率远低于在当前技术条件下进行分离抗原特异性TCR所需的各种操作所需的频率。因此，TCR分离工作通常从允许富集具有所需抗原特异性的T细胞的方法开始。以下部分介绍了用于TCR发现的几种常见的T细胞富集方法。

  在某些类型的实体癌中，通常存在大量肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。与外周血T细胞相比，肿瘤组织内的T细胞通常富集在具有肿瘤抗原特异性的克隆中。一些研究小组使用扩展的TIL作为发现肿瘤特异性TCR的来源。有必要注意一下的是，几十年来，离体扩增的TIL本身就是几种类型实体癌的有效ATC。Iovance的TIL疗法lifileucel已在临床试验中显示出强大的疗效，该公司计划提交FDA批准。

  对感兴趣的抗原具有特异性的T细胞能够最终靠疫苗接种策略选择性地在体内扩增。一种常见的方法是用感兴趣的抗原接种人HLA转基因小鼠，这可以导致从淋巴结和脾脏收获的抗原特异性T细胞的稳健富集。在特定情况下，参与癌症疫苗试验的患者的外周血已被用作TCR发现中抗原富集T细胞的来源。

  已经开发了几种策略，以抗原特异性方式在体外刺激外周血T细胞，以所需的特异性驱动T细胞的选择性扩增。这方面的早期开创性工作是对外周血T细胞进行体外刺激，以优先扩增病毒特异性T细胞。这些刺激方法已被用于扩增富含TAAs和新抗原特异性的T细胞。这一些方法通常通过自体抗原呈递细胞（APC），通常是树突状细胞（DC），以外源肽的形式或通过cDNA / RNA递送与感兴趣的抗原一起脉冲来刺激T细胞。 在患者来源的外周血的情况下，几项研究表明，初始选择PD-1 +和/或抗原经历（CD45RO+ CD62L+、CD45RO+ CD62L-或CD45RO- CD62L-）T细胞能更加进一步增强肿瘤特异性T细胞的体外富集。

  为了克服产生自体成熟DC进行抗原刺激的要求，开发了所谓的人工抗原呈递细胞（aAPCs）。一种常见的aAPC系统使用骨髓性白血病细胞系K562，该细胞系对HLA-A、B和DR呈阴性。该细胞系通过种种HLA等位基因和共刺激分子的稳定转导作为模块化aAPC。已经开发了其他无细胞aAPC系统，将HLA和共刺激分子偶联到珠子和纳米颗粒上。

  在获得富集具有目标特异性的T细胞的多克隆T细胞产物后，有必要从大量T细胞群中分离抗原特异性T细胞。

  这方面的方法通常涉及用感兴趣的同源抗原刺激T细胞，然后基于已知T细胞活化相关分子的表达增加来分离抗原反应性T细胞。这包括跨膜蛋白的抗体染色，这些蛋白在T细胞刺激后被瞬时上调（例如，分别在CD8+和CD4+ T细胞中的4-1BB和OX40），允许通过FAC分选或磁珠分选分离这些细胞。另一种方法是IFN-γ捕获，根据IFN-γ的产生来鉴定和捕获抗原刺激的T细胞，IFN-γ由抗原刺激的CD8+和Th1 CD4+ T细胞快速分泌。在某些情况下，使用肽-HLA多聚体染色，接着进行FAC分选或磁珠分选是鉴定和分离抗原特异性T细胞的有效方法。然而，这需要预先了解抗原限制性HLA和最小表位。尽管HLA多聚体试剂的库正在扩大，但这些试剂仍然局限于相对常见的HLA等位基因。

  然后通过PCR扩增从cDNA克隆α和β的T细胞链。然而，一个独特的挑战是他们的5区域高度可变。为客服这一点，一般会用两种PCR变体之一，5RACE或多重PCR。TCR特异性由两个独立基因的区域编码的事实为从T细胞群中确定功能性TCR序列带来了独特的挑战；也就是说，一旦裂解T细胞进行RNA提取，来自每个T细胞克隆的TCR α和TCR β转录产物混合，使得哪个TCR α序列与哪个TCR β序列配对变得模糊。因此，在对抗原特异性T细胞的功能性TCR α和β链转录本进行测序之前，常常要首先分离单个T细胞克隆。虽然绝不是详尽无遗的，但我们在这里概述了几种经典和新兴的策略，以分离T细胞克隆进行TCR测序。

  获得T细胞克隆的经典方法是单个孔中T细胞克隆的生长。在极限稀释方法中，将T细胞稀释以获得细胞浓度，从而允许将大约一个细胞沉积到96孔板的每个孔中。另一种方法是FAC对T细胞群进行分类，以将单个细胞递送到每个孔中。目标是获得感兴趣的T细胞的扩增克隆群体，然后可以额外筛选抗原特异性并通过Sanger测序进行测序。

  一些研究已经通过执行单细胞RT-PCR来扩增TCR α和β链，从而避免了在抗原特异性T细胞分离后扩增T细胞克隆的需要。在这种方法中，将单个T细胞FAC分选到含有RT-PCR反应缓冲液的孔中，并从单个细胞进行RT-PCR，并将TCR α和β链进行PCR扩增。这种方法减少了扩增单个T细胞克隆所需的时间和劳动力；然而，这种方法的缺点是，在测序之前不能对T细胞克隆做评估抗原特异性的验证性测定。

  单细胞RNA测序（scRNAseq）是一项加快速度进行发展的技术，已成为TCR发现的独特有效平台，因为它允许对细胞基因表达以及基因转录序列进行单细胞评估。因此，最近的几项研究已经成功地将该平台用于TCR的发现，方法是用感兴趣的抗原刺激T细胞，接着进行scRNAseq。这使得研究人员可以通过增加效应细胞因子（如IFN-γ，TNF-α和/或IL-2）来鉴定抗原特异性T细胞，然后从相同的数据集中获得激活细胞的TCR α和β链的转录本序列。

  TCR的发现工作通常产生具有所需抗原特异性的几种TCR序列。如何从此候选列表中选择最佳TCR？一旦选择了主要的TCR，能够直接进行哪些临床前评估来预测临床成功的可能性？以下部分描述了临床前TCR研究中通常评估的几个TCR特征。

  通常，必须确定的孤立TCR的第一个特征是其HLA限制（图3）。了解TCR的HLA限制不仅需要识别可能对TCR-T治疗有反应的患者，还有必要进行许多实验以进行临床前评估。在几种TCR发现方法的情况下，HLA限制的知识已经纳入管道中，例如在接种HLA转基因小鼠或使用HLA四聚体选择T细胞的情况下，在这种情况下，所得TCRs的HLA限制几乎是确定的。然而，在不包含HLA限制的先验知识的TCR发现方法中，例如通过自体DC刺激，HLA限制一定要通过实验确定。一种常用的方法是将单个克隆的HLA等位基因递送到非人灵长类动物COS-7细胞系中，该细胞系具有抗原处理和呈递能力，但不表达潜在的混杂内源性人HLA等位基因。然后诱导COS-7细胞通过递送cDNA / RNA或肽负载来表达其中一个HLA候选物和感兴趣的抗原，并与TCR-T细胞共同培养。在这里，抗原限制HLA是显而易见的，因为HLA通过功能反应观察到，例如细胞因子分泌和/或4-1BB / OX40上调。

  图3TCR可识别特定 HLA 等位基因呈递的抗原。TCR抗原主要由六个 HLA 基因呈递。这些基因包括HLA I类（A，B和C）和II类（DR，DP和DQ）的基因。这些HLA基因是高度多态的，在人群中有许多等位基因变异。人类从每个父母那里继承一组基因，因此人类细胞能表达多达十二个不同的HLA等位基因。对于给定的TCR，呈现同源肽的特定HLA等位基因被称为TCR的“限制性HLA”。

  TCR与适当的pMHC复合物之间的成功相互作用是有效抗肿瘤免疫应答的关键组成部分。TCR亲和力和活力描述了TCR和pMHC之间的结合和动力学相互作用。亲和力在TCR敏感性和特异性中起核心作用，指的是相互作用的活力。亲和力通过表面等离子体共振（SPR）进行量化，SPR是一种3D相互作用，根据结合速率（Kon）和解离速率（Koff)一起测量，Koff和 Kon组成结合常数 （KD），其中 KD= koff/kon。高亲和力TCR识别较低水平的抗原，不需要CD8辅助受体，并能使CD4+ T细胞以MHC类I依赖性方式识别和裂解肿瘤细胞。

  TCR活力通常与亲和力相关，并指多种TCR-pMHC相互作用、辅助受体（CD8）、TCR密度和T细胞功能状态的组合效应。活力的不同方面（即结构或TCR亲和力）能够最终靠用pMHC单体或具有确定价的多聚体染色来测量。TCR亲和力、活力和各种动力学常数都直接或间接地有助于功能性亲和力，这描述了表达特定TCR的T细胞如何响应肽丰度降低，有时被称为抗原敏感性。TCR功能亲和力的评估通常包括测量TCR-T细胞因子分泌或细胞溶解功能，以响应以滴定浓度的肽脉冲的靶细胞。

  HLA I类表位是肽片段，通常长度为8-12个氨基酸，由蛋白酶体处理泛素化蛋白而产生。蛋白酶体是一种大型蛋白质复合物，负责降解内源性蛋白质，这些蛋白质已被细胞破坏或不需要，并且已被泛素偶联标记。蛋白酶体20S催化核心的亚基β1、β2和β5与蛋白酶体的三大催化活性有关。虽然包含亚基β1，β2和β5的蛋白酶体被称为“标准蛋白酶体”，但造血细胞和受某些炎性细胞因子（例如INF-γ，IFN-α，IFN-β和TNF-α）刺激的细胞交替表达β1i，β2i和β5i亚基，这些亚基取代了蛋白酶体中的β1，β2和β5亚基，形成称为“免疫蛋白酶体”的同种型。免疫蛋白酶体显示出几种影响肽切割活性的生化差异。这导致与标准蛋白酶体相比，产生免疫蛋白酶体的肽产物具有增强的免疫原性，因为这些免疫蛋白酶体生成的肽更有可能含有C端疏水性残基，其与更有效的HLA-I类结合有关。此外，还有含有标准蛋白酶体和免疫蛋白酶体亚基混合物的“中间蛋白酶体”，特异性地仅取代β5i或β1i加β5i，并产生类似于免疫蛋白酶体产生的肽库，但包含别的独特的肽产物。

  几种肿瘤抗原现在已被表征为由标准、中间体和/或免疫蛋白酶体产生。由于用于富集肿瘤特异性T细胞的树突状细胞主要表达中间体和免疫蛋白酶体，因此大多数临床前TCR很可能能够识别由免疫蛋白酶体和/或中间蛋白酶体产生的抗原。这些同源肽可能由标准蛋白酶体额外产生，也可能不由标准蛋白酶体产生。同源肽的蛋白酶体需求能够最终靠几种方式确定。许多细胞系主要表达标准蛋白酶体，但会响应IFN-γ上调免疫蛋白酶体亚基。因此，TCR-T细胞的反应可以与抗原表达细胞系作比较，无论是不是用IFN-γ预处理。肽蛋白酶体需求也通过测试T细胞对表达293细胞的抗原的反应来确定，无论是不是过度表达特定的诱导蛋白酶体β亚基。人们越来越认识到蛋白酶体处理动力学在免疫疗法中的重要性，例如免疫检查点阻断和TCR-T疗法。在治疗性TCR识别仅由免疫蛋白酶体处理的肽的情况下，选择肿瘤已确认免疫蛋白体亚基表达的患者可能是有用的。由于免疫蛋白酶体亚基的下调现在已经在某些癌症类型中观察到，治疗性TCR识别由标准和免疫蛋白酶体产生的抗原可能是理想的。

  最重要的是确定TCRs的潜在安全问题，因为以前的临床试验已经观察到on-target off-tumor毒性和off-target毒性的严重病例。本节介绍评估临床前TCR及其同源抗原靶标安全性的最新技术。

  在候选TCR靶向新型或推定的TAA或CGA表位的情况下，必须临床前评估其在健康组织中的表达模式和HLA表现。在施用表达亲和力增强TCR的T细胞后，两名患者发生了致命的神经毒性，从而明确了这种验证的重要性，该T细胞识别了MAGE-A3和MAGE-A12共有的表位。对这些患者进行的尸检显示，大脑中CD3+ CD8+ T细胞浸润。进一步的研究发现MAGE-A12在人脑神经元的一个子集中的意外表达。现在有几种策略可用于临床前评估应采用的推定CGA或TAA靶标的表达谱。Kunert等人根据他们评估MAGE-C2衍生表位的表达谱的经验提供了建议的策略，该表位现在正在临床靶向（NCT04729543）。作为评估推定的TAAs或CGAs的早期步骤，作者建议查阅在线数据库，如人类蛋白质图谱（和CT数据库（cta.lncc.br），这些数据库汇编了有关健康和癌组织中许多基因的RNA和蛋白质表达的文献中的广泛数据。最近出现的用于验证和/或发现CGAs和TAAs的另一个工具是HLA配体图谱（hla-ligand-atlas.org），这是一种开源的社区资源，其中包含最初从21个个体的29个不同的非恶性组织收集的综合人类HLA配体组数据。为了通过实验和独立评估健康组织中的抗原表达，Kunert等人建议对来自各种健康组织类型的市售cDNA文库进行qPCR，如果可能的话，通过在健康组织类型面板上进行IHC来进一步评估蛋白质表达。

  除了确定同源抗原靶标的安全性外，调查候选TCR的潜在脱靶反应性也至关重要。这种研究的临床重要性通过两名患者的死亡来突出，这是由于亲和力增强的MAGE-A3特异性TCR对心肌细胞中表达的肌动蛋白衍生表位的脱靶反应性。研究人员现在一般会用几种临床前策略来识别候选TCR的可能脱靶反应。已经确定了同源肽中的特定氨基酸，这些氨基酸是TCR识别所必需的。这是通过突变同源肽中的每个残基并鉴定无法引发T细胞反应的突变版本来实现的。然后，研究人员利用诸如BLAST和ScanProsite之类的网络工具搜索含有相同或相似氨基酸基序的所有其他人类肽，然后评估这些结构相似的肽是否引起候选TCR的反应。在鉴定出一种或几种脱靶肽的情况下，研究人员通过确定滴定浓度下的TCR-T细胞反应或确定脱靶肽是否实际上能够自然处理进一步研究了这些肽的免疫原性。虽然这种方法对于鉴定结构上与同源肽相似的交叉反应肽非常有价值，但它不会鉴定介导交叉反应性的结构上不同的肽。

  一些小组还通过进行功能测定来评估治疗性TCR的潜在异体活性，其中TCR-T细胞用表达各种HLA等位基因的许多不同的淋巴母细胞系（LCL）培养。Sanderson等人强调了这种方法的效用，他们发现先导HLA-A*02:01限制性MAGE-A4特异性TCR介导了HLA-A*02:05的同种素，表明表达HLA-A*02:05的患者应被排除在使用该TCR的治疗之外。

  TCR α/β链主要是通过TCR恒定区域内的相互作用形成异源二聚体。TCR-T应用面临的挑战是，常规T细胞表达的内源性TCR α/β链可以与引入的TCR α/β链配对。这种TCR错误配对会产生一些后果。首先，TCR错配降低了引入的TCR的表面表达，因为引入的TCR α/β链的很大一部分将参与与内源性TCR α/β链的非生产性错配。此外，错误配对的TCR与工程化的TCR异源二聚体竞争与限制性CD3组分的结合。TCR错误配对的第二个后果是生产了尚未进行胸腺选择的全新TCR，并且可能对自身抗原具有意想不到的特异性。事实上，TCR错配被证明会在小鼠中引起致命的移植物抗宿主病（GVHD），并导致体外同种异体活性和自身反应性人T细胞的形成。然而，迄今为止，在人类TCR-T临床试验中尚未观察到GVHD的发病率，包括使用未修饰的人TCR的早期TCR-T试验。为了尽最大可能避免与 TCR 错误配对相关的问题，绝大多数 TCR-T 应用程序现在至少使用一种策略来减少TCR错误配对（图4）。

  图4TCR修改可防止错误配对并最大限度地提高表面表达效果。内源性TCR和工程TCR 之间错误配对的图示。糖基化的TCR用小鼠TCR恒定区域取代人类TCR恒定区域。通过半胱氨酸取代在TCR恒定区添加额外的二硫键可稳定工程TCR α/β链的链间结合亲和力，同时降低其与内源性TCR α/β链的结合亲和力。工程化的TCR α链的稳定性能够最终靠在其跨膜域中选择疏水取代来提高。结构域交换的TCR将工程TCR的大型或特定段反转α/β恒定区，以此来降低了工程TCR的错配倾向。单链TCR（scTCR）将TCR抗原识别和信号传导域编码为单链。三结构域和双结构域 scTCR 的不同之处分别在于TCR包含或缺失β恒定区。基因组工程策略利用RNA干扰或内切酶技术来减少或消除内源性TCR表达。

  Cohen等人偶然观察到，与人源性TCR相比，当用小鼠来源的TCR进行工程改造时，人类T细胞表现出更大的生物活性，Cohen等人证明，在存在内源性人类TCR α/β链的情况下，小鼠TCR α/β链优先地相互二聚。研究人员进一步证明，当人类TCR的恒定区域被小鼠恒定区域取代时，引入的TCRs的优先配对也能轻松实现。使用具有小鼠恒定区域的工程TCR的一个问题是，外来小鼠序列可能会在患者中引发免疫反应，正如在其他利用外来蛋白如绿色荧光蛋白和HyTK自杀基因的细胞治疗试验中观察到的那样。一项研究确定了6/26名用表达完全小鼠TCR的TCR细胞治疗后患者的抗小鼠TCR抗体。然而，表位图谱显示抗体对TCRs的可变区域具有特异性，而不是恒定区。在利用具有浑浊恒定区的人TCR的单独TCR T试验中，在接受筛查的11例患者中，均未检测到抗TCR血清抗体。总之，这些临床发现表明小鼠TCR恒定区域具有低或可忽略不计的免疫原性。尽管如此，也已经开发出通过取代特定的小鼠氨基酸序列来部分模糊TCR的策略。

  内源性TCR α/β链在TCR α恒定区（Cα）残基94和TCR β恒定区（Cβ）残基130之间形成二硫键。通过在Cα残基48和Cβ残基57处通过半胱氨酸取代引入第二个稳定的二硫键能改善引入的TCR的适当配对，这增加了引入的TCR α/β链的链间结合亲和力，同时降低了与内源TCR α/β链的结合亲和力。

  内源性TCR α链具有相比来说较低的稳定性，能够最终靠在Cα跨膜区域内取代亮氨酸和缬氨酸残基来增加稳定性。TCR α链含有这些稳定突变，称为α-LVL，显示出增加的TCR表面表达和生物活性。虽然这种策略通过稳定TCR α链来促进引入的TCR的配对，但TCR β链保持不变，因此有可能会出现错误配对。然而，这能够最终靠将α-LVL取代物掺入粘性TCR中来解决，其组合可以协同增强TCR表达和生物活性。

  通过TCR晶体结构分析，鉴定出几种介导TCR α/β二聚化的氨基酸。通过交换两个这样的相互作用残基，Cα甘氨酸和Cβ精氨酸，产生了突变的TCR α/β链，具有相似的二聚化倾向，但与未修饰的内源性TCR α/β链结合的倾向显着降低。Bethune等人在设计TCR时采用了类似的策略，其中交换了大面积的Cα和Cβ段，称为dsTCRc。有趣的是，引入的dsTCRc α/β链与内源性α/β链的错配是完全检测不到的。TCR结构域交换/共轭策略的其他例子包括与γδ TCR恒定区交换，用CD3ζ或CD28 / CD3ε替换区，或与亮氨酸拉链二聚体基序共轭。

  为了将TCR α/β异源二聚体的抗原识别特性结合到单链中，几个小组开发了所谓的三结构域单链TCR（scTCR），它由短肽连接物融合的Vα / Vβ区域组成并结合到Cβ结构域【153，158，159】。为了介导信号转导，三域scTCR通常进一步与CD3ζ共轭。比较了九个与CD3ζ偶联的三结构域scTCR构建体的功能，无论是不是与附加刺激域CD28和Lck偶联。尽管CD28和Lck的加入改善了scTCR功能，但没有一个scTCR结构在功能亲和力方面表现得不如原生TCR。scTCR构建利用CD3ζ跨膜和信号传导域的功能独立于CD3复合物，理论上允许使用scTCRs比使用天然TCR实现更高的表面表达，因为scTCRs不受CD3组分丰度的限制。scTCRs的CD3独立性也可能有益于需要维持内源性TCR表达水平的应用中。然而，scTCRs利用的信号机制与CD3依赖性天然TCR不同，这可能部分解释了scTCRs的功能亲和力降低。为了产生保持CD3依赖性的scTCRs，Voss等人设计了一个系统，其中没有CD3ζ共轭的三结构域TCR与Cα结构域共表达。以这种方式，三结构域scTCR与共表达的Cα结构域二聚，在细胞表面呈四结构域结构，类似于天然TCR异源二聚体的结构。有趣的是，这些scTCR / Cα结构具有与天然TCR相似的功能亲和力。然而，Aggen等人证明，由于Cβ结构域的存在，三结构域scTCRs继续在某一些程度上与内源性TCR α链不匹配。为了生成完全消除错误配对的scTCR系统，该小组生成了双结构域scTCR，其利用稳定的Vα / Vβ突变来避免对Cβ结构域的需求。为了介导信号传导，双结构域 SCTCR 与细胞内信号传导结构域（如CD3ζ和CD28）偶联。有趣的是，含有双结构域scTCR的CD3ζ/CD28本质上是利用Vα/Vβ抗原识别结构域的CAR。因此，双结构域 scTCR 显示出 CARs 的典型特征，包括CD3非依赖性信号传导和对低抗原密度的敏感性降低。然而，与典型的CAR不同，双结构域scTCR 仍然依赖于HLA的表现。

  其他策略不是修改引入的TCR，而是通过敲除或淘汰内源性TCR来解决错误配对问题。Provasi等人将锌指核酸酶（ZFN）的使用与WT-1特异性TCR的慢病毒递送相结合，敲除内源性TRAC和TRBC基因。在这里，作者描述了一个优雅但相对广泛的制造系统，该系统利用TRAC / TRBC中断，磁珠分选和TCR α/β链交付的顺序轮次。这导致TCR-T产物具有增强的引入TCR的表达并且绝对没内源性TCR α/β链。在最近的一项首次人体试验中，Stadtmauer等人采用多重CRISPR/Cas9编辑来破坏T细胞TRAC、TRBC和PDCD1基因，并结合NY-ESO-1特异性TCR的慢病毒递送。在本报告中描述的四种患者衍生产品中，平均分别在45%和15%的细胞中实现了TRAC和TRBC的破坏。然而，由于TRAC / TRBC编辑的T细胞在使用NY-ESO-1 TCR进行慢病毒转导之前未被选中，因此TCR工程T细胞的很大一部分可能继续表达内源性TCR α/ β链。一些小组还开发了无病毒系统来提供TCRs和/或破坏内源性TRAC / TRBC基因，这也可能有助于提高TCR T临床成本和可行性。Davo等人电穿孔T细胞用Dicer-底物小干扰RNA（DsiRNA）靶向内源性TRAC和TRBC位点，分别使TRAC和TRBC的表达降低约6倍和3倍。然后，用密码子优化的WT1特异性TCR电穿孔T细胞，DsiRNA没办法识别。这导致T细胞产物具有相比来说较高的工程TCR表达（60.2%四聚体+），并且没有观察到TCR错误配对。然而，由于该系统中的转基因表达是短暂的，这在大多数情况下要在临床环境中多次输注。Roth等人使用CRISPR /Cas9编辑来调解TCR α和β可变区域的靶向插入分别进入TRAC和TRBC位点的第一个外显子。这介导了破坏内源性TCR α/β链的综合效应，同时将引入的TCR的表达置于生理控制之下。这种方法的潜在挑战是编辑效率相比来说较低，约3%的细胞表达引入的TCR，因此在大多数情况下要分选和/或扩展选择性扩增。

  鉴于亲和力在TCR功能中起着核心作用，制造高亲和力TCR是提高TCR-T疗法疗效的一种着迷的方法。天然存在的TCRs，包括那些识别自身/肿瘤抗原的TCR，由于阴性选择具有相比来说较低的亲和力。提高TCR亲和力的方法侧重于将氨基酸序列（AAS）变异引入TCR互补性决定区域（CDR）。例如，通过重叠PCR生成了单AAS替换，增强了NY-ESO-1（1G4）和MART-1（DMF4，DMF5）特异性TCR的功能。这些TCR具有低μM甚至nM范围内的亲和力，超过了大多数天然存在的TCR的亲和力，其范围从1-100μM。酵母和噬菌体显示是额外的功能强大，高通量工具，可以生成具有pM范围的亲和力的TCR。 虽然这些技术是有效的识别高亲和力TCR变体，更高的亲和力已经与增加的交叉反应性相关。亲和力大于正常范围（1-100μM）的TCR更有可能表现出对相似或完全不同的肽的交叉反应性。在高亲和力TCRs的各种研究中，增加nM和pM范围内的亲和力导致识别对照抗原和抗原阴性靶细胞。因此，提高TCRs亲和力的努力应谨慎和彻底评估，因为这些高亲和力TCR在用作病人治疗时可能会产生不利影响。

  最近在TCR亲和力成熟方面的工作重点是对TCR的结构及其如何与目标pMHC相互作用进行更彻底的评估。Hellman等人利用结构引导设计，包括正面和负面设计。换句话说，他们利用了增强或削弱TCR与MHC蛋白相互作用的突变。这些突变以一种迫使TCR-pMHC相互作用更多地依赖于正确靶肽的存在的方式重新分配了结合自由能，以此来降低了脱靶肽的灵活性。在MART-1特异性DMF5 TCR中，这些结构引导的修饰降低了与MART-1同系物的交叉反应性，并消除了对选择的不同肽的交叉识别。因此，结构引导的方法有可能改善以青蒿素为基础的联合疗法，同时最大限度地降低脱靶毒性的风险。

  截至2021年10月3日，clinicaltrials.gov 中的搜索词“TCR”（以及同义词“T细胞受体”和“T细胞抗原受体”）产生了538项干预试验。通过对这些试验的人工检查，确定了119项包括TCR-T细胞的过继转移。还确定了一项未包括这些检索词的TCR-T试验（NCT04044768），并将其纳入本分析。第一项TCR-T试验于2004年由美国国立卫生研究院（NIH）的Steven Rosenberg发起，靶向黑色素瘤分化抗原gp100（NCT00085462）。从那时起，启动的新TCR T试验的数量稳步增加，在2017年至2019年期间特别加速，其中启动了51项新的TCR-T试验（图5A）。在迄今为止的TCR-T试验中，53%处于I期，24%处于I/II期，22%处于II期。迄今为止，尚未启动III期TCR T试验（补充表1）。截至11月3日，对这些TCR T试验的状况做了评估。第三，2021 年（图 5B），在116项TCR T试验中，有118项抗原靶向，具有特定的靶点。在靶向抗原中，大多数是CGAs（47%），其次是病毒抗原（24%），肿瘤相关抗原（21%），新抗原（7%）和胎儿癌基因（3%）（图5C）。CGA NY-ESO-1是迄今为止TCR T试验中靶向最多的抗原（36项试验）。虽然HPV直到2014年才首次靶向，但现在是第二常见的TCR T靶点（10项试验）。虽然黑色素瘤分化抗原MART-1是TCR T试验（7项试验）中第三大靶向抗原，但这些试验在很大程度上构成了早期TCR T试验，因为MART-1靶向试验自2012年以来始终没启动（图5D）。迄今为止，大多数TCR T试验用来医治实体癌（85%），其次是血液系统恶性肿瘤（9%），以及针对实体癌和血液学癌症的试验（2%）。一小部分TCR T试验用来医治HIV，CMV或EBV感染（4%）（图5E）。有关这些TCR T试验的确切疾病靶点的更多信息，请参见补充表1。在具有特定HLA限制的100项试验中，列出了111项限制性HLA等位基因，因为一些试验包括多个抗原靶标和HLA限制。HLA-A*02是迄今为止最常见的限制性HLA等位基因（80%），其次是HLA-A*11（7%）和HLA-A*24（5%）。HLA II类限制性抗原在3项试验中靶向，均采用HLA-DP*04（3%）限制（图5F）。大多数TCR T试验地点位于美国（56%），其次是中国（18%）和英国（6%）（图5G）。在美国进行的80项TCR T试验中，44%由NIH赞助，28%由学术机构赞助，29%由行业赞助。行业对TCR T的支持在2017年左右加速（补充表1），可能有助于后期TCR T试验的发展。到目前为止，NCI一直是美国TCR T试验中最活跃的个人机构，迄今为止赞助了31项试验。在学术机构中，弗雷德·哈钦森癌症研究中心赞助了最多的试验（7项试验），其次是约翰逊综合癌症中心（6项试验）。在制药公司赞助的TCR-T试验中，Adaptimmune和葛兰素史克赞助的试验最多（各8项试验）（图5H）。

  图5迄今为止启动的TCR-T试验的趋势。截至2021年10月3日，对 clicaltrials.gov 注册的TCR-T试验进行了评估。（A）每年启动的新TCR-T试验的数量以及按年分列的注册TCR-T试验的累计数量。（B）120项TCR T试验的临床状况。（C）116项TCR T试验中118个肿瘤抗原靶点的分类。（D）TCR T试验中十个最常见的靶点。（E）TCR T试验所针对的疾病。（F）在指定HLA限制的100项TCR T试验中111个靶抗原限制性HRA的频率。（G）按国家分列的进行TCR T试验的地点。（H）在美国进行的80项TCR T试验的主要申报者。

  有大量文献详细的介绍了TCR-T试验的结果。表1详述了超过25项TCR-T试验的临床结果。本节讨论这些早期试验得出的广泛发现，特别是与TCR-T安全性和有效性相关的发现。有必要注意一下的是，许多TCR T临床方案包括TCR T输注前的淋巴细胞耗竭方案，这在早期的ACT试验中已被证明能改善T细胞的植入和持久性。许多研究还包括在TCR T输注后全身给予IL-2，以支持T细胞活性和持久性。这两种干预措施都一致地诱发各种毒性，虽然这些毒性是不可取的，但通常在临床上是可控的。对这些干预措施影响的详细说明超出了本评价的范围，但在另外的地方进行了广泛的审查。因此，对在TCR T试验中观察到的毒性的讨论将集中在那些由输注的T细胞直接介导的毒性上。最后，有必要注意一下的是，迄今为止，所有TCR-T试验都处于早期阶段，几乎专门治疗高度晚期的难治性疾病患者。

  在最早的一项TCR T试验中，转移性黑色素瘤患者用TCR（DMF4）转导的自体T细胞治疗，识别黑色素瘤分化抗原MART-1。这些患者的客观缓解率相对适中，2/17（12%）的患者达到持久的部分缓解。未观察到TCR T诱导的毒性。在后来的一项相关研究中，患者接受TCR-T细胞治疗，这些细胞表达更高的亲和力MART-1特异性TCR（DMF5）。与先前使用较低亲和力DMF4受体的试验相比，该试验观察到疗效增强，在6/20（30%）的患者中观察到客观反应。然而，由DMF5 TCR介导的生物活性增加也与黑色素细胞靶外肿瘤破坏的出现有关，导致广泛的红斑性皮疹（19pxs），葡萄膜炎（16pxs）和听力损失（13pxs）。在用表达高亲和力的小鼠衍生TCR靶向黑色素瘤分化抗原gp100治疗的患者中观察到类似的结果。在后来的一项研究中，三名转移性结直肠癌患者接受了亲和力增强的TCR治疗，识别癌症分化抗原癌胚抗原（CEA）。虽然在1/3（33%）的患者中观察到部分反应，但由于表达CEA的结肠粘膜的靶外肿瘤破坏，所有三名患者都出现了严重的短暂性结肠炎。最终，这些研究表明，虽然靶向癌症分化抗原的TCR-T疗法可以介导客观的临床反应，但它们通常与潜在的危险靶向肿瘤外毒性有关。可能正因为如此，在过去十年中，很少有针对癌症分化抗原的TCR-T试验启动。

  CGA NY-ESO-1一直是TCR-T试验中最广泛靶向的抗原，一些研究小组现在已经发表了靶向这种抗原试验的有希望的结果。一项早期具有里程碑意义的试验使用表达亲和力增强的 NY-ESO-1 特异性 TCR 的TCR-T细胞治疗难治性黑色素瘤或滑膜肉瘤患者，报告了 11/20（55%）黑色素瘤患者的客观反应，包括 4 例持久完全缓解，以及 11/18（61%） 滑膜肉瘤患者（包括1例持久完全缓解）。未观察到TCR T相关毒性。后来，一项针对使用表达亲和力增强的NY-ESO-1特异性TCR（SPEAR T细胞）治疗的滑膜肉瘤患者的大型研究观察到15/42患者（36%）的临床反应，包括一个完全反应，以及24/42个表现为稳定疾病的患者。这些患者还根据NY-ESO-1肿瘤表达的大小和他们接受的淋巴细胞补充方案分为治疗队列。在12名患者（队列1）中观察到最大的临床反应，这些患者的肿瘤通过免疫组织化学在≥50%的细胞中表达+2或+3 NY-ESO-1染色，并接受了相对密集的淋巴细胞消除方案。在这里，在6/12（50%）的患者中观察到临床反应，包括一个完全反应，中位反应维持的时间为30.9周。在这12名患者中，有5名经历了1级（3pxs），2级（1 pts）或3级（2 pts）的细胞因子释放综合征。其他几项报道靶向NY-ESO-1治疗各种癌症类型的TCR-T试验的研究也观察到临床反应，没有归因于TCR-T细胞的靶向或脱靶毒性实例。总之，这些研究表明，靶向TCR-T疗法的NY-ESO-1是安全的，还可以引发有效的抗肿瘤反应。

  MAGE-A家族的蛋白质也作为极具吸引力的CGA靶标，现在有几项靶向该家族成员的TCR T试验的结果已经公布。不幸的是，两份针对MAGE-A3的试验的早期报告描述了致命的TCR-T介导的毒性。在一项研究中，两名接受TCR T细胞治疗的患者在TCR T输注后死于心脏毒性，这些TCR细胞表达了亲和力增强的MAGE-A3特异性TCR。对这些死亡原因的事后调查揭示了对心肌细胞中表达的肌动蛋白的亲和力增强TCR的交叉反应性。这项研究强调需要对铅TCR的潜在脱靶反应性进行广泛的临床前调查。在同年发表的一项研究中，九名转移性癌症患者接受了TCR T细胞治疗，这些TCR细胞表达亲和力增强的TCR识别出相似的MAGE-A3和MAGE-A12表位。5/9（56%）的患者获得了临床反应，包括一名患者的持久完全反应。然而，三名患者在TCR T细胞输注后经历了严重的神经毒性，其中两名患者因此而死亡。事后分析在大脑中的神经元子集中发现了MAGE-A12的意外表达，因此观察到的毒性被认为是由于MAGE-A12大脑的靶向肿瘤外识别。这项研究表明，需要对健康组织中的同源抗原靶标进行广泛的临床前表征。后来的一项研究靶向了来自T调节细胞的高亲和力HLA-DPB1 * 04:01限制性TCR的MAGE-A3。4/17（24%）的患者达到客观反应，其中一名患者达到持久的完全缓解。TCR T 治疗后，一名患者出现4级毒性，包括 ALT、AST和肌酐升高，最终出现呼吸衰竭，需要住院治疗。第二位患者出现持续2天的 ALT、AST和肌酐升高的3级毒性。这些毒性的原因没有描述。最近两份关于TCR T细胞表达对MAGE-A4（ADP-A2M4 SPEAR T细胞）特异性的亲和力增强TCR的I期试验的两份报告观察到抗肿瘤反应，但没有证据说明严重的TCR T介导的毒性。今年，Adaptimmune报告了ADP-A2M4 SPEAR T细胞（现为无损体自白细胞）的II期试验结果，用来医治滑膜肉瘤或黏液样/圆细胞脂肪肉瘤（MRCLS）患者。在这里，在13/33（39.4%）的患者中观察到客观反应，包括两个持久的完全反应，并且在28/33（84.8%）的患者中实现了疾病控制。在21名患者中观察到1-2级CRS，在一名患者中观察到3级CRS。依据这一些数据，该公司计划明年申请afamitresgene autoleucel的批准。总之，针对MAGE-A3的早期TCR T试验根据结果得出，需要对TCR的on-target和off-target效应进行更广泛的临床前测试，并且由于这些研究而出现了增强的临床前安全性评估策略。然而，Adaptimmune的MAGE-A4靶向afamitresgene autoleucel的最新试验已经证明，在没有主要TCR T细胞介导的毒性的情况下，治疗实体癌的疗效很强，并且可能接近FDA批准。

  最近的研究结果已经证明了TCR T细胞靶向HPV抗原在各种HPV相关实体癌患者中的疗效。在一项治疗12名表达E6特异性TCR的TCR T细胞患者的研究中，取得了相对适度的疗效，在2/12（17%）的患者中观察到客观反应，没有剂量限制性毒性。在一项使用识别E7的更高亲和力TCR的相关研究中，在6/12（50%）的患者中实现了客观反应，其中一种剂量限制性毒性可能与TCR T介导的毒性无关。然而，在两项试验中观察到的临床反应维持的时间相对较短（2-9个月）。最近的研究还证明了靶向癌症过表达抗原WT1的TCR T试验的安全性和有效性。在一项研究中，12名造血细胞移植（HCT）后复发风险较高的AML患者接受了同种异体EBV特异性T细胞治疗，这些细胞被设计成表达WT1特异性TCR。100%的TCR治疗患者实现了无复发生存期，而在具有相似复发风险的88名AML患者的比较组中，HCT后无复发生存率为54%。9名患者在TCR T输注后表现出1-2级GVHD，其中一名患者发展为3级急性GVHD。然而，GVDH被确定最大有可能是由使用同种异体T细胞而不是引入的TCR引起的。

  近年来，出现了关于TCR-T疗法在血液恶性肿瘤和实体瘤背景下的安全性和有效性的临床试验（表1）。与CAR-T试验相比，几项专注于后者的TCR T试验取得了更好的治疗效果，现在看来，TCR T疗法更接近于获得FDA批准用来医治实体癌。这种差异的可能解释在于TCRs和CARs之间的生物学差异（图1），包括1）TCRs识别来自任何细胞区室的HLA呈递抗原的能力，包括高特异性抗原，如CGAs和病毒抗原；2）与CAR相比，TCRs对低浓度的靶抗原更敏感， 特别是在亲和力增强的TCR的情况下；3）与CAR T细胞不同，工程TCRs不驱动配体非依赖的强直信号传导，使它们更好地维持体内功能。最终，上述因素被推测在靶向实体癌的TCR-T疗法相对改善的性能中发挥作用，然而，随着新的抗原发现和T细胞的进一步基因工程，这两个领域都在快速地发展，这应该会导致马上就要来临的实体瘤CAR-T试验的疗效提高。

  已经做出了巨大的努力来了解和解决限制基于T细胞的ACTs的疗效和临床适用性的因素，包括TCR-T疗法。本节介绍目前TCR-T疗法面临的一些挑战以及应对这些挑战的策略。

  TCR-T产品常常要1-3周的制造时间，并且涉及几个相对复杂的加工步骤，必须在高度监管的良好生产的全部过程（GMP）设施中进行。尽管相对复杂，但目前的TCR-T制造工艺通常会导致高成功产品制造率。然而，这些T细胞产品的成本很高。FDA批准的CAR-T疗法的高成本证明了这一点，这些疗法利用类似的制造工艺。例如，单次输注axicabtagene ciloleucel或tisagenlecleucel的费用分别为373,000美元和475,000美元。为此，许多团体正在制定的一项战略是使用同种异体或现成的TCR-T和CAR-T产品。然而，这种方法面临的一个主要挑战是GVHD由异体T细胞介导的可能性。介导异基因T细胞产物GVHD的策略包括使用抗原特异性严格限制的寡克隆病毒特异性T细胞，不变的T细胞亚群，如γδT细胞和iNKT细胞，或TRAC / TRBC破坏T细胞。降低TCR-T和CAR-T产品制造成本的另一种策略是使用非病毒基因递送方法，如RNA电穿孔，转座子和CRISPR/Cas9。

  输注的T细胞在患者体内持续存在的能力是介导ACT抗肿瘤疗效的主要的因素。因此，已经做出了巨大的努力来开发改善T细胞持久性的策略。也许最常见的策略是在T细胞输注之前进行非清髓性淋巴细胞充血化疗，这减轻了输注的T细胞与内源性T细胞对稳态细胞因子（如IL-7和IL-15）的竞争，以及别的可能的机制。几项针对小鼠的研究表明，与高度分化的T细胞亚群（例如，效应器记忆和终末分化的效应子）相比，分化较少的T细胞亚群（例如，中央记忆和干细胞记忆）在体内移植和持久性得到一定的改善。因此，现在一般会用几种策略来保存ACT制作的完整过程中分化较少的T细胞亚群，包括减少扩增时间和使用较少的分化诱导细胞因子。一些TCR-T试验通过在输注前选择特定的T细胞分化亚群（NCT02062359，NCT02408016）进一步扩展了这种方法。限制T细胞持久性的另一个因素是肿瘤微环境刺激配体的缺乏。几项早期TCR T试验对疫苗进行了联合管理，以努力在体内提供TCR刺激和共刺激。然而，这些研究中的几个未能观察到增加的TCR-T疗效通过与疫苗接种组合介导。改善T细胞共刺激的遗传策略包括结合共刺激结构域的改良TCR和仅共表达共刺激的COS或结构域交换的抑制受体。最后，还正在探索几种遗传策略来维持T细胞稳态细胞因子信号传导，包括自分泌IL-15或IL-12元件和组成活性IL-7受体。

  过继转移T细胞面临的另一个障碍是免疫抑制肿瘤微环境（TME）。TME通过招募免疫抑制细胞类型来支持肿瘤存活，包括骨髓来源的抑制细胞（MDSC），调节性T细胞（Tregs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。ACT的几项临床前研究正在努力结合使T细胞在敌对TME中发挥作用的策略，包括与免疫检查点阻断共同处理，以及倒置细胞因子受体或MDSC靶向共刺激受体的遗传掺入。全方面了解TME及其对T细胞的影响对于ACT未来成功治疗实体癌是必要的。

  TCR-T功效受肿瘤细胞同源抗原表达异质性的影响。当靶向CGAs时尤其如此，例如NY-ESO-1和MAGE-A家族蛋白，它们通常由肿瘤异质表达。尽管如此，在靶向NY-ESO-1和MAGE-A家族蛋白的TCR-T细胞治疗的患者中观察到完全反应（表1）。这可以部分解释为一种称为表位扩散的现象，即由输注的TCR-T细胞引发的免疫反应导致内源性T细胞启动并激活到其他非同源肿瘤抗原。事实上，在接种疫苗和ACT后，在人类中观察到表位传播。现在已经开发了几种基因工程策略来促进表位扩散，包括组成性表达炎症细胞因子IL-12和IL-18、CD40L或DC生长因子FLT3。解决抗原异质性的另一种方法是在遗传上编码对多种抗原的特异性。虽然在CAR-T领域已经开发了几种多靶向方法，但迄今为止在开发多靶向TCR-T疗法方面取得的进展要少得多。

  TCR-T疗法也容易受到APM途径中扰动的肿瘤细胞逃逸的影响。HLA级I级和其他APM组分（如TAP1）的下调已被观察到在许多癌症类型。这些逃逸机制的影响已经在TCR-T和TIL试验中得到了明确的证明，其中肿瘤APM成分的突变导致肿瘤逃逸和癌症进展。这些研究强调了迫切地需要解决这种肿瘤内在逃逸机制的策略，特别是当我们正真看到TCR-T治疗药物的抗肿瘤功效进一步提升时。在肿瘤下调APM途径的情况下，这些成分的表达能够最终靠施用干扰素或表观遗传修饰药物来恢复。解决APM组件因硬连线基因突变而丢失的情况更具挑战性。在小鼠中研究的一种策略是用腺病毒载体原位基因递送β2M。然而，这种方法通过肿瘤内注射将腺病毒递送到比较小的肿瘤（直径7-10mm）中，因此尚不清楚这种方法是否对肿瘤较大，难以进入和/或分散的患者有效。因此，APM成分硬连线缺失的患者在大多数情况下要接受HLA非依赖性疗法（如CAR-T）的治疗。这些TCR结合天然折叠的表面蛋白，类似于CAR，但在pMHC-TCR相互作用范围内具有结合亲和力。

  免疫疗法已迅速崛起，成为癌症治疗的主要支柱之一。其中，TCR工程化的T细胞疗法是一个迅速增加，活跃和发展的领域。自1986年首次报告通过TCR转移重定向T细胞特异性以来，TCR-T疗法及其应用取得了巨大进展。新兴技术和增强的策略使TCR发现工作在时间和成本效益方面大幅度的提升。这将允许更多的群体参与TCR的发现，并最后导致靶向新肿瘤抗原的TCR增加，并仅限于更广泛的HLA范围内。早期TCR-T试验的几项临床发现塑造了过去十年的TCR-T发展。在早期试验中观察到的毒性导致TCRs的临床前安全性评估得到一定的改善，并向肿瘤特异性增加的抗原靶标过渡。自2015年以来，治疗各种实体癌和血液恶性肿瘤的TCR-T试验结果不断涌现。其中几项试验在没有严重毒性的情况下显示出令人印象非常深刻的临床反应，现在看来，TCR-T疗法治疗实体癌的首次批准可能马上就要来临。这些早期结果使人们有理由对TCR-T疗法的持续发展持乐观态度。